دانلود دستورالعمل روش انجام آزمایش آنتی بیوگرام

دستورالعمل روش انجام آزمايش آنتي بيوگرام

هدف:
اطمینان از صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت دارويي باكتريهاي بيماريزاي شناخته شده بر اساس روش انتشار ديسك در آگارDisk Diffusion

دامنهکاربرد:
این دستورالعمل جهت انجام صحيح آزمايش آنتي بيوگرام در بخش میکروبیولوژی و آنالیز ادرار آزمایشگاه کاربرد دارد .

صلاحیت و شایستگی کاربر:
جهت حصول اطمینان از نحوه صحیح این آزمایش توسط پرسنل بخش، مطالعه کامل این دستورالعمل همراه با گذراندن دوره آزمایشی به مدت 7 روز کاری یا حداقل 5 RUN کاری تحت نظر مسوول بخش مربوطه الزامی است.

اقدامات وابسته :
آگاهی از برنامه کنترل کیفی آزمایشگاه
آگاهی از اصول ایمنی در آزمایشگاه

ذخيره سازي و نگهداري ديسكهاي آنتي بيوتيكي:
ديسكها بايد در يخچال 8 درجه سانتيگراد و پايين تر، يا در فريزر 14- درجه سانتيگراد و پايين تر تا زمان مصرف نگهداري شوند.
تمامي ديسكهاي گروه بتالاكتام مانند پني سيلين، آمپي سيلين، كربني سيلين، تيكارسيلين، اگزاسيلين و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورين ها و ... بايد در فريزر نگهداري شوند و فقط مي توان مقداري از آن را بر اساس كار روزانه آزمايشگاه حداكثر به مدت يك هفته در يخچال نگهداري نمود.
بعضي آنتي بيوتيكهاي حساس مثل ايميپنم، سفاكلر و تركيبات كلاولانيك اسيد يا سولباكتام اگر تا هنگام مصرف در فريزر نگهداري شوند، پايداري بيشتري خواهند داشت.
ديسكها بايد در ظروف داراي درپوش محكم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند.
ديسكهاي آنتي بيوتيكي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند.

تجهيزات و لوازم مورد نياز:
محيط كشت مولر هينتون آگار
خط كش
ديسك هاي آنتي بيوگرام
چراغ الكلي
پنس استريل

روش انجام آزمایش :
در شرايط استريل توسط سواب پنبه اي مقداري از كشت ميكروبي (كه بايد ميزان كدورت سوسپانسيون باكتري با كدورت نيم مك فارلند مطابقت داشته باشد) را در تمام سطح پليت مغزي تلقيح كنيد.
ديسك هاي آنتي بيوگرام را بوسيله پنس استريل در سطح پليت قرار داده و با كمي فشار آنها را كاملاً بر سطح آگار بچسبانيد.
پليت ها را به صورت وارونه در گرمخانه 37 درجه به مدت 24 ساعت نگهداري كنيد.
پس از طي دوره انكوباسيون، بوسيله خط كش، قطرها در عدم رشد را در اطراف ديسك ها اندازه گيري و ثبت كنيد و با توجه به جدول همراه ديسك ها، گزارش تست آنتي بيوگرام را براي هر يك از آنتي بيوتيك ها به صورت حساس (Sensitive)، مقاوم (Resistant) يا نيمه حساس (Intermediate) گزارش كنيد.

نكات مهم در انجام تست آنتي بيوگرام:
براي تلقيح نمونه، ابتدا با سواب استريل سوسپانسيون ميكروبي را مخلوط كرده، سواب را با قدرت به ديواره لوله تكيه داده و فشار دهيد تا آب اضافي آن گرفته شود، سپس آن را به محيط مولر هينتون انتقال داده و تماس سطح محيط را به چمني تلقيح كنيد.
ديسك هاي آنتي بيوگرام را نيم ساعت قبل از كاشت در محيط كشت، بيرون از يخچال قرار دهيد.
قبل از استفاده از محيط كشت آنها را از يخچال خارج نموده و به مدت 20 -10 دقيقه در انكوباتور 37 درجه قرار دهيد تا رطوبت موجود در سطح آگار خشك گردد.
ديسك ها را به صورت دايره اي و به فاصله 2/1 سانتي متر از يكديگر بكاريد.
ضخامت محيط كشت مولرهينتون آگار بايد به طور يكنواخت در تماس پليت ها 5 ميليمتر باشد.
بايد توجه داشت كه ديسك هاي مورد استفاده متناسب با نوع باكتري انتخاب شود، براي مثال: هيچگاه براي باكتري گرم منفي ديسكم پني سيلين استفاده نكنيد، زيرا نسبت به آن مقاوم است و يا براي كشت ادرار از ديسك كلرامفنيكل استفاده نكنيد، براي اينكه اين آنتي بيوتيك نمي تواند وارد مجاري ادراري شود.
هنگام خواندن نتيجه دقت كنيد كه همواره امتداد خط كش از وسط ديسك عبور كند.
هميشه قطر هاله عدم رشد را اندازه گيري كنيد.
هميشه نگاه بدبينانه داشته و كوتاهترين مسير را براي تعيين حساسيت انتخاب كنيد.
اگر در اطراف ديسك حتي يك كلني هم باشد، بايد از همانجا تا ديسك را اندازه گيري كرده قطرهاله را ....
قطره هاله عدم رشد را در زير نور بررسي و تعيين كنيد.
پس از تلقيح باكتري به محيط آنتي بيوگرام، در فاصله حداكثر 15 دقيقه بايد ديسك ها در سطح آگار كاشته شوند.
در برخي از باكتريهاي سخت رشد براي انجام تست آنتي بيوگرام، از محيط هاي كشت اختصاصي استفاده مي شود.
جهت تلقيح حتماً از ايزوله خالص استفاده شود. اگر نمونه مورد استفاده خالص نباشد، تست كاملاً اشتباه خواهد بود.
تا زماني كه ديسك را روي محيط فشار نداده ايد، مي توانيد جاي آن را تغيير دهيد، اما بعد از فشار دادن ديسك و تثبيت آن، به هيچ عنوان ديسك را جابجا نكنيد.
قبل از كاشت ديسك ها بررسي كنيد كه حاوي مشخصات باشد.
اگر نمونه تلقيح شده پس از انكوباسيون به صورت يك دست رشد نكرده باشد، نشان دهنده اين است كه مقدار كلني برداشت شده كمتر از استاندارد مك فارلند بوده است.
اگر در اطراف تمام ديسك ها هاله تشكيل شود و يا در اطراف هيچ يك از ديسك ها هاله اي تشكيل شود، بايد تست تكرار شود.
اگر PH محيط مولرهينتون آگار مناسب نباشد نتايج اشتباه بدست مي آيد.
نگهداري غلط ديسك ها و استفاده از محيط هاي كشت تاريخ گذشته موجب خطا مي شود.
بسياري از باكتريها كم كم به آنتي بيوتيك هاي مختلف مقاوم مي شوند، كه اين مي تواند عمر آنتي بيوتيكها را به سوي افول هدايت كند.
استفاده زياد از سولفوناميدها باعث بيماريهاي عصب شنوايي و يا بيماريهاي كليوي خواهد شد.
مصرف زياد پني سيلين باعث ترومبوسيتوپني و مصرف زياد تتراسايكلين موجب گرانولوسيتوپني مي شود.
ديسك ها بايد حداكثر به مدت يك ماه در يخچال و بيش از يك ماه در فريزر نگهداري شوند.
آمينوگليكوزيدها بر روي باكتريهاي بي هوازي بي هوازي بي‌تأثير هستند.
كلرامفنيكل در نمونه ادراري استفاده نمي شود، زيرا وارد مجاري ادراري نمي گردد.
تتراسايسكلين آنتي بيوتيك وسيع الطيفي است و معمولاً به صورت موضعي استفاده مي شود.

كنترل كيفي:
هدف از برنامه كنترل كيفي پايش و ارزيابي موارد ز ير مي باشد:
صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت
مواد و وسايل به كار برده شده در اين آزمايش
عملكرد افرادي كه آزمايش را انجام داده و نتايج بدست آمده را قرائت مي نمايند.به منظور دست يابي بهينه به اين اهداف در دسترس داشتن سويه هاي كنترل كيفي تهيه شده از مراكز معتبر ضروري است.
سويه هاي كنترل كيفي پيشنهادي توسط CLSI عبارتند از:

• Enterococcus faecalis ATCC 29212
• Escherichia coli ATCC 25922
• Escherichia coli ATCC 35218
• Haemophilus influenza ATCC 49247
• Haemophilus influenza ATCC 49766
• Klebsiella pneumonia ATCC 700603
• Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
• Staphylococus aureus ATCC 25923
• Streptococcus pneumonia ATCC 49619
• E.coli ATCC 35218 فقط به عنوان يك ميكروارگانيسم كنترلي براي تركيبات ممانعت كننده بتالاكتاماز، مثل تركيبات حاوي كلاولانيك اسيد، سولباكتام يا تازوباكتام پيشنهاد مي شود.
• nterococcus faecalis ATCC 29212 (يا E.faecalis ATCC 33186) براي ارزيابي محيط مولرهينتون آگار با ديسك تري متوپريم/سولفامتوكسازول استفاده مي شود. در محيط كشت قابل قبول، هاله عدم رشد واضحي به قطر mm 20 يا بزرگتر ايجاد مي شود درحاليكه در محيط هاي كشت غيرقابل قبول، هاله عدم رشد ايجاد نمي شود يا در داخل هاله، رشد كم مشاهده مي شود و يا هاله اي با قطر كمتر از mm 20 ايجادمي گردد. اين كار به منظور بررسي مقادير غيرقابل قبول تيميدين در محيط كشت مزبور است.
• Enterococcus faecalis ATCC 29212 همچنين براي كنترل ديسكهاي آمينوگليكوزيد با دوز بالا به كار مي رود.
• Klebsiella pneumonia ATCC 700603 به عنوان يك سويه كنترلي براي آزمايشات ESBL به كار برده مي شود.

كنترل كيفيت قطر هاله عدم رشد سويه كنترلي/ديسك آنتي بيوتيكي:
سويه هاي كنترل كيفي را بايد به روش استاندارد آزمايش disk diffusion‌ و با استفاده از همان مواد و روشي كه براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي كلينيكي استفاده مي شود آزمايش و نتايج را با جداول 3 و ‍CLSI3A مقايسه و بررسي نمود. محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه كنترلي نيست به يك ديسكم آنتي بيوتيكي در جداول فوق فهرست شده است.
چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد، احتمالاً ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باكتري نسبت به آن آنتي بيوتيك مي باشد. در اين صورت لازم است كشت تازه از سوش كنترل تهيه شود.
آزمايش كنترل كيفيت را بايد در چه فواصل زماني انجام داد؟
انجام آزمايش روزانه
براي هر سويه كنترلي با يك ديسك آنتي بيوتيكي بايد 20 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد.